آزمایشگاه میکروبیولوژی محیطی

آزمایشگاه میکروبیولوژی محیطی

آزمایشگاه میکروبیولوژی محیطی

فرمت: Pdf تعداد صفحات: 37

• آزمایش شماره 1: مطالعه میکروارگانیسم های خاک

• آزمایش شماره 2: آزمایش باکتریولوژیکی آب

• آزمایش شماره 3: تهیه ستون وینوگرادسکی

• آزمایش شماره 4: جداسازی و مطالعه ازتوباکتر

• آزمایش شماره 5: جداسازی و مطالعه ریزوبیوم

• آزمایش شماره 6: جداسازی و مطالعه باکتری های اکسیدکننده آمونیاک و اکسیدکننده نیتریت

• آزمایش شماره 7: جداسازی و مطالعه اسیدی تیوباسیلوس

• آزمایش شماره 8: جداسازی و مطالعه باکتری های تجزیه کننده سلولز

• آزمایش شماره 9: جداسازی و مطالعه باکتری های اسپوردار

• آزمایش شماره 10: جداسازی و مطالعه استرپتومیست ها

• آزمایش شماره 11: مطالعه باکتری های بالکینگ کننده

• ضمیمه: طرز تهیه انواع معرف ها و رنگ ها

مطالعه میکروارگانیسم های خاک

خاک محیط مناسبی برای رشد میکروارگانیسم ها است و حیات خاک وابستگی زیادی به فعالیت میکروارگانیسم های آن دارد. نوع و تعداد میکروارگانیسم های موجود در خاک به نوع خاک، شرایط فیزیکی- شیمیایی خاک، درشتی و ریزی ذرات تشکیل دهنده خاک، میزان رطوبت و درصد خلل و فرج موجود در خاک بستگی دارد. در چند سانتیمتر از بخش فوقانی خاک تعداد میکروارگانیسم ها حداکثر بوده و به تدریج هر چه عمق بیشتر می شود تعداد آن ها رو به کاهش می گذارد. باکتری های فراوانی را می توان از خاک جدا کرد که بسیاری از آن ها در کشاورزی و زراعت مفید هستند و تعدادی نیز سبب بروز بیماری های خطرناکی در انسان و حیوان می شوند. برای میکروب های بیماری زای انسانی و حیوانی که به زندگی انگلی عادت کرده اند، خاک محیط نامساعدی است و اغلب این میکروب های بیماری زا که قدرت زندگی در خاک را دارند، انواع اسپوردار می باشند. اسپور باسیلوس آنتراسیس (عامل سیاه زخم در انسان و حیوانات) در برخی از خاک ها، ده ها سال به حالت اسپور باقی می ماند.

کلستریدیوم تتانی (عامل کزاز)، کلستریدیوم بوتولینوم (عامل بوتولیسم) و کلستریدیوم پرفرنجنس (عامل گاز گانگرن) نیز مثال های دیگری از میکروب های بیماری زای اسپوردار ساکن خاک می باشند.

باکتری های موجود در خاک از صدها گونه بسیار مختلف تشکیل می شوند. میکروارگانیسم هایی که هیف تشکیل می دهند مانند اکتینومیست ها (و قارچ ها) به طریقی با خاک سازگاری یافته اند که بهترین شرایط برای آن ها زمانی است که غلظت مواد غذایی در خاک افزایش می یابد. علت این سازگاری این واقعیت است که هیف قارچ و اکتینومیست قادرند تا ذرات مواد آلی خاک را که به صورت جدا از هم قرار گرفته اند کلونیزه نموده و بین مناطقی که از نظر مواد غذایی غنی هستند پلی را ایجاد نمایند. همچنین وجود اسپور به لحاظ پراکندگی این دو دسته از میکروارگانیسم ها و همچنین از نظر مقاومت در طول مدتی که رشد نمی کنند دارای اهمیت هستند. جنس استرپتومیسس گاهی تا 90% از جمعیت اکتینومیست های خاک را تشکیل می دهد. گونه های استرپتومیسس تولیدکننده آنتی بیوتیک های مهم پزشکی هستند و با تولید ترکیبات فراری مثل ژئوسمین سبب ایجاد بوی خاص خاک می شوند. گونه های باکتریایی مؤثر در چرخه های کربن، نیتروژن و گوگرد نیز در خاک ها وجود دارند که در جلسات آزمایشگاهی بعدی به جداسازی و مطالعه برخی از آن ها پرداخته خواهد شد. در این جلسه میکروارگانیسم های خاک را به دو صورت مورد مطالعه قرار خواهیم داد:

الف) جداسازی، شمارش و شناسایی باکتری های موجود در خاک

روش های متعددی برای تخمین تعداد باکتری ها در خاک وجود دارد که هر روشی مزایا و محدودیت های خاص خود را دارد. روشی که انتخاب می شود به عوامل زیادی از جمله نوع باکتری مورد مطالعه، نیازهای غذایی و ویژگی های محیط کشت مورد استفاده بستگی دارد. در این آزمایش از روش ساده سریال رقت استفاده خواهد شد. به دلیل اینکه بسیاری از باکتری های خاک نیازهای غذایی نسبتاً ساده ای دارند و به سرعت بر روی محیط های کشت ساده آزمایشگاهی رشد می کنند غالباً از این روش برای شمارش جمعیت های باکتریایی خاک استفاده می شود. اصل بنیادی در روش شمارش سریال رقت این نکته است که هر سلول باکتری موجود در خاک به هنگامی که به داخل یک محیط کشت جامد تلقیح شده و در شرایط مناسب انکوبه گردد کلونی قابل مشاهده ای را تولید خواهد کرد. از این رو، این روش فقط برای شمارش سلول های زنده مورد استفاده قرار می گیرد. بطور معمول تعداد باکتری های خاک بسیار زیاد است و از10⁶ تا بیش از 10⁸ باکتری در هر گرم از خاک متغیر می باشد. از آن جهت که جداسازی و شمارش دقیق این تعداد زیاد از باکتری ها در یک ظرف پتری دیش امکان پذیر نیست بنابراین بایستی سلول های باکتریایی نمونه خاک مورد آزمایش قبل از تلقیح بر روی محیط کشت به نسبت مناسب رقیق گردند.

برای جداسازی باکتری های موجود در خاک ابتدا باید نمونه خاک مورد نظر را از کلیه مواد زائد، لاشه گیاهان، دانه های درشت سنگ و سایر مواد پاک کرد و سپس خاک را با یک غربال ریز الک نموده تا یک خاک نرمی را بدست بیاوریم. در مرحله بعد مقدار 1 گرم از این نمونه خاک نرم را وزن کرده و به یک ارلن حاوی 99 میلی لیتر از آب مقطر استریل (و یا هر محلول بافر رقیق سازی دیگر) اضافه می کنیم و ارلن را به خوبی تکان داده تا نمونه خاک اضافه شده به خوبی با آب مقطر مخلوط و یکنواخت شود. با این نسبت از خاک به آب مقطر، جمعیت باکتری های خاک تقریباً 100 برابر رقیق می شوند (رقت 10^-2).

رقت های بعدی به ترتیب با انتقال 1 میلی لیتر از سوسپانسیون سلولی به لوله های حاوی 9 میلی لیتر از آب مقطر استریل تهیه می شوند. در ادامه، میزان 0.1 میلی لیتر از رقت مورد آزمایش را در شرایط آسپتیک به روش پخش بر روی محیط کشت بر روی سطح یک محیط کشت استریلی که از قبل در یک پتری دیش ریخته شده و به صورت جامد درآمده است تلقیح می کنیم (در این آزمایش از دو محیط جامد نوترینت آگار و آگار خوندار استفاده می شود) و با کمک یک میله شیشه ای سرکج استریل بطور یکنواخت بر سطح محیط کشت پخش می نماییم. محیط نوترینت آگار را به مدت 3 الی 5 روز در دمای آزمایشگاه و محیط آگار خوندار را نیز به مدت 24 تا 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرماگذاری می کنیم تا کلونی ها ظاهر شوند. در این روش از تلقیح، چون پلیت آگار با 0.1 میلی لیتر از محلول رقیق شده قبلی تلقیح شده است بنابراین یک رقت 0.1 دیگر نیز از سلول های موجود در سوسپانسیون ایجاد می شود. در نتیجه، رقت کل پلیت های تلقیح شده با  0.1 میلی لیتر از سوسپانسیون های سلولی موجود در لوله های آزمایش 2، 3، و 4 در شکل 1 به ترتیب 10^-4 10^-5 ، 10^-6 خواهد بود. معمولاً برای سوسپانسیون های سلولی با رقت های مختلف، تکرارهایی نیز در نظر می گیرند و میانگین تعداد کلونی های تشکیل شده در سطح پلیت ها را بعنوان تعداد باکتری ها در نمونه خاک اولیه بکار می برند. بطور معمول پلیت هایی که کمتر از 30 و یا بیشتر از 300 کلونی تشکیل داده اند شمارش نمی گردند چون که محاسبات در مورد تعداد کلونی ها خارج از این محدوده چندان دقیق نمی باشد.

در نهایت، تعداد باکتری ها در هر گرم از نمونه خاک مورد آزمایش با ضرب کردن تعداد کلونی ها (یا میانگین تعداد کلونی ها در صورت انجام چندین تکرار برای هر رقت) در عکس ضریب رقت کل هر پلیت برآورد می شود. بعنوان مثال اگر پلیتی که با 0.1 میلی لیتر از لوله سوم تلقیح شده است 125 کلونی ایجاد نماید، تعداد باکتری ها در نمونه خاک برابر با 1.25×10⁶ باکتری در هر گرم از نمونه خاک و یا Colony Forming Unit (CFU)/ml گزارش خواهد شد.

بعد از تخمین تعداد باکتری ها در هر گرم از خاک، اقدام به بررسی خصوصیات ماکروسکوپی کلونی های موجود بر روی محیط کشت نموده و در صورت لزوم آن ها را خالص سازی می کنیم. در صورتی که نیاز به شناسایی کامل باکتری ها تا حد جنس و یا گونه باشد می توان با انجام رنگ آمیزی گرم، رنگ آمیزی اندوسپور، تست های بیوشیمیایی و غیره، باکتری جداشده را شناسایی نمود.